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ELISA操作常见问题和解决方法

时间:2015-04-22 作者:市场部 文章来源: 浏览:4331


ELISA操作常见问题和解决方法


 

ELISA即酶联免疫吸附实验,是目前广泛应用于各种抗原抗体检测的方法,主要有灵敏度高和特异性强的特点。ELISA操作步骤看似简单,整个测定过程中却有诸多影响因素,导致检测结果可能与实际结果偏差较大。为帮助大家分析实验中常见问题,我们将常见问题的可能原因和解决方法归纳总结于下表:

 

问题一:高背景或阴性对照值偏高

能原因

建议

阴性对照孔被阳性对照或样品污染

洗涤时,勿将洗液溢出孔外

抗体非特异性结合 

封闭液不适合,更换封闭液

酶结合物过浓

请检查酶结合物是否按说明书规定稀释

孵育温度过高

检查孵育箱的温度是否正确、稳定

底物在使用前曝光

应保存在暗处,避光

读板前停留时间过长

加终止液后3分钟内读数

 

问题二:阳性对照值偏低或低吸光度

能原因

建议

试剂未平衡至室温

实验开始前,将试剂盒从冰箱取出平衡至室温

检测体积偏小

检查移液器吸液管道是否堵塞

孵育时间过短 

使用计时器,准确孵育时间 

底物受污染 

使用新配置的试剂,重新实验

包装袋中有湿气 

检查袋中是否有干燥剂 

样本中有抑制剂

叠氮钠会抑制HRP酶的活性 

 

问题三:边缘效应

能原因

建议

蒸发 

各步之间,须使用封版胶密封反应板

温度不均匀 

校准孵育箱,勿叠放反应板


问题四:标准曲线不佳 

可能原因

建议

倍比稀释标准品时未混匀 

稀释标准品的每一步均需混匀

过早稀释

标准品在快要使用时稀释

加入的体积不正确

使用校准过的移液器,快速、等量的将标准品分配到各个微孔中

 

问题五:标准曲标准曲线良好,但样本无检测信号

可能原因

建议

样本中无检测物或检测物含量极低

设置内参,重新实验

样本中其他物质影响/掩盖检测

作适当稀释,降低其他物质的干扰,或作系列稀释,检测回收率

样本中检测物浓度过高,Hook效应导致假低值

适当倍数稀释样本,检测物浓度尽量在试剂盒检测范围内

 

问题六:重复性较差

可能原因

建议

微孔中有气泡

用针尖挑破气泡

试剂未混匀

确保充分混匀试剂

样本中有杂质或沉淀物

使用前离心

微孔包被面被吸头划破

加液时小心操作

使用用过的封板胶纸

每次须使用新的封板胶封住反应孔

 

问题七:假阳性反应

可能原因

建议

洗涤不充分 

使用前需检查洗板机是否正常工作

洗板机管道堵塞

需经常维护洗板机 

加结合物时,洒在微孔边缘 

小心向微孔加入结合物,加入微孔底部中央,避免与孔壁和边缘接触 

检测样本中含有红细胞 

离心 

微孔中液体挥发 

用封板胶密封反应孔,置于湿盒内 

 

问题八:整块板产生阳性OD值或整个板显蓝色

可能原因

建议

洗涤液体积不足或底物被残留于孔底的结合物所污染 

洗涤时,缓冲液充满至孔边缘,但要确保不能溢出孔外

结合物浓度过高

检查是否按照说明书推荐比例稀释 

血清中有血清因子 

勿加热血清 

底物容器不洁净 

用酸清洗容器瓶,用蒸馏水冲洗

底物孵育时,微孔板曝光 

加底物时,立即将板置于暗处


问题九:整块板OD值偏低

可能原因

建议

显色时间不足 

适当延长显色时间 

孵育温度偏低 

36度为最适反应温度(欣博盛ELISA试剂盒) 

未加终止液 

加入终止液,增强颜色反应的强度,稳定最终的颜色反应 

 

问题十:显色缓慢

可能原因

建议

样本未置于室温 

实验开始前,将样本平衡至室温 

酶结合物活性减弱 

检测稀释度 

酶活性收到抑制如叠氮钠 

避免实验不当的防腐剂 

显色温度不适当 

按说明书操作