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小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的培养

时间:2016-01-15 作者:市场部 文章来源: 浏览:1748

  DC 是“Dendritic Cells”的缩写,中文全称为“树突状细胞”,因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC 是由2011 年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家Ralph M. Steinman 于1973 年发现的,是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已证实,DC 是唯一能够显著刺激初始T 细胞(Naïve T cells)增殖的APC,而其它种类的APC(如单核巨噬细胞,B 细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T 细胞,因此DC 是机体适应性T 细胞免疫应答的始动者,在肿瘤免疫中发挥着极其重要的作用。


  虽然DC 存在于体内多种组织中,但含量很少,无法满足科学研究和临床治疗的需要,所以人们尝试多种方法来体外培养和扩增DC。对于人,最常用的方法是从人外周血单个核细胞(PBMC)诱导DC 的产生。而对于小鼠,最常见的方法是从骨髓细胞诱导产生DC,即髓来源的DC(Bone Marrow-Derived Dendritic Cells,BMDC)


【步骤简图】





本文主要介绍:

【经典的BMDC 培养法】-Inaba 法(改良) 
【BMDC大量制备法】-Son 法
【BMDC 大量制备法】-Lutz 法
【注意事项】


【经典的BMDC 培养法】-Inaba 法(改良) 

背景:


1. Inaba 法获得的BMDC 数目为5-7 x 106 个/小鼠;
2. Inaba 原法操作比较复杂,需要将骨髓中的淋巴细胞等用抗体+补体法预先去除,后来的改良法均省却了这个步骤,其实Inaba 后来自己也说这个步骤虽然可提高BMDC 的纯度,但不会对BMDC 的生成产生影响,可做可不做[10];

3. Inaba 原法仅用GM-CSF 来诱导BMDC 的产生,虽然得到的BMDC 在混合淋巴细胞反应中有较强的刺激能力,但DC 的成熟度不及GM+IL-4 的联合诱导,所以后来的改良法中多用GM+IL-4 联合诱导。


培养步骤:



1. 小鼠骨髓细胞的获得
1.1 小鼠(6 - 10 周龄)颈椎脱臼法处死,手术取出所有股骨(femurs)和胫骨(tibias),并剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净;
注:不要损伤到骨。
1.2 将骨移至超净台内,并用盛有70%酒精的无菌培养皿浸泡2-5min,以消毒灭菌,然后用无菌的PBS 洗2 次;
1.3 将骨移入另一个盛有PBS 的新培养皿中,用剪刀剪去骨两端,再用注射器抽取PBS,针头分别从骨两端插入骨髓腔,反复冲洗出骨髓至培养皿中,直至
骨完全变白;
1.4 收集骨髓悬液,用200 目尼龙网滤去小碎片和肌肉组织;
1.5 滤过液1200 rpm 离心5min,弃上清;
1.6 加入2 ml 氯化铵红细胞裂解液(1x),重悬细胞,室温孵育3-5min,最长10min;


氯化铵红细胞裂解液的配制:
1. 先配制10x的贮存液,配法如下:
称取82.9g NH4Cl,10.0gKHCO3和0.37g Na2EDTA,溶于1L的蒸馏水中,0.22μm滤膜过滤除菌,4oC储存6个月;
注:可根据需要配制适量的10x贮存液,其中各组分需成比例增减。
2. 临用前,将10x贮存液用无菌蒸馏水1 : 9稀释成1x工作液即可。 注:因氯化铵红细胞裂解液对骨髓细胞有一定的伤害作用,所以要尽量缩短溶血时间。

1.7 加入10 ml PBS 中和裂解液的作用,然后1200 rpm 离心5min,弃上清;
1.8 PBS 洗1 次,然后用含10% FBS 的RPMI 1640 培养液重悬细胞,至此已获得小鼠骨髓细胞。

2. BMDC 的诱导分化

2.1 步骤1 中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为0.5-1 x 106/ml;
2.2 铺至24 孔培养板内,每孔1ml 细胞,同时加入重组小鼠GM-CSF (20ng/ml)和IL-4 (10ng/ml),37℃,5% CO2 培养箱培养,此为培养的第0 天;
注:1) 一般一只小鼠大约可收获4-5 x 107个骨髓细胞,所以可以铺至少40-50个24 孔板板孔。
        2) GM-CSF 和IL-4 的使用浓度区间分别为20-50ng/ml 和10-40ng/ml。
2.3 每2 天轻轻摇晃培养板,然后3/4 体积更换新鲜培养液,并补足细胞因子。
2.4 在第5 天和第8 天之间,轻柔吹打培养液,收集悬浮细胞及巯松贴壁生长的细胞;
2.5 1200 rpm 离心5min,弃上清;
2.6 用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培养液重悬细胞并计数,然后调整细胞浓度至1 x 106/ml,并加入重组小鼠GM-CSF (20 ng/ml)和IL-4 (10ng/ml);
2.7 细胞铺板至100 mm 培养皿(每皿最多10ml)或6 孔培养板(2m/孔)。
2.8 37℃,5% CO2 培养箱继续培养1-2 天;
2.9 收集悬浮细胞,即为较成熟的BMDC。

3. BMDC 的完全成熟
注:步骤2 中获得的BMDC 并非完全成熟的DC,若想得到完成成熟的DC,还需LPS,CD40L 或TNF-a 等的诱导。
3.1 步骤2.4 或2.9 中获得的BMDC 以1200rpm 离心5min,弃上清;
3.2 用含重组小鼠GM-CSF (20 ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)的RPMI 完全培养液重悬沉淀,计数后调整细胞浓度为1 x 106/ml;
3.3 加入24 孔培养板中,并加入成熟诱导剂,如TNF-α (250U/ml),LPS (1μg/ml)、或CD40L(1μg/ml)等;
3.4 37℃,5% CO2 培养箱培养2 天;
3.5 收集悬浮细胞及疏松贴壁生长的细胞即为成熟树突状细胞。


【BMDC 大量制备法】-Son 法

背景:


1. 该法可在7 天内获得30-40 x 106 个DC/小鼠,是Inaba 经典方法的7-10 倍。DC经14.5%甲泛葡胺(Metrizamide)梯度离心后,纯度(即CD11c+/I-Ab+细胞)可达85-95%。
2. 该法获得的DC 的内吞能力弱于Inaba 经典方法,但分泌的IL-12p70 量相似;
3. 该法获得的DC 在混合淋巴细胞反应中比Inaba 经典方法呈现更强的刺激能力;
4. 该法获得的DC 能引起更强的特异性T 细胞反应;
5. 以上结果提示,该法比经典方法能获得更多、更成熟的BMDC。


培养步骤:


1. 小鼠骨髓细胞的获得
见Inaba 法(改良)中的相应步骤。


2. BMDC 的大量制备
2.1 步骤1 中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为2 x 105/ml;
2.2 铺至6 孔培养板内,每孔5ml 细胞,同时加入重组小鼠GM-CSF (1000U/ml)和IL-4 (1000U/ml),37℃,5% CO2 培养箱培养;
2.3 在培养的第4 天,向培养体系中补充重组小鼠GM-CSF (1000U/ml)和IL-4(1000U/ml);
2.4 培养的第7 天收集DC,用2-4ml RPMI 1640 完全培养液重悬,加至等体积的14.5%(w/v) 甲泛葡胺上,1200 x g 室温离心20min;
注:此时的DC 为不完全成熟的BMDC,要想进一步成熟,请跳至步骤3。
2.5 收集中间层,并用RPMI 1640 完全培养液洗3 次备用。

3. BMDC 的完全成熟
3.1 步骤 2.4 中收集的BMDC,重新铺板,并向培养体系中加入重组小鼠GM-CSF(1000U/ml)和IL-4 (1000U/ml),以及LPS (1-10μg/ml)
3.2 37℃,5% CO2 培养箱培养2 天,获得成熟的BMDC。

【BMDC 大量制备法】-Lutz 法

背景:


1. Lutz 法与Son 法相似,均可大量制备BMDC,但与Son 法相比,Lutz 法更为广泛地被采用。
2. 该法可获得更多的BMDC,达1-3 x 108 个/小鼠,而且纯度可达90-95%;
3. 该法比Son 法使用的细胞因子浓度低得多,仅为200U/ml,而且培养的第8 天到第10 天降为30-100U/ml,这样可以大幅节约试剂成本;
4. 该法与Inaba 经典方法和Son 法的最大不同是使用细菌培养皿(Petri dish)而非细胞培养板来培养骨髓细胞。Inaba 的解释是细菌培养皿不容易使骨髓中的巨噬细胞贴壁,从而抑制巨噬细胞的发育,进而避免巨噬细胞对DC 成熟的抑制作用,这可能是该法能够以较低铺板密度获得大量BMDC 的主要原因。
5. 但该法的培养时间较长,需要10-12 天,一方面是为了获得更多的BMDC,另一方面,大多数粒细胞和淋巴细胞很难存活这么长时间,因此可提高最终获得的BMDC 的纯度;
6. 该法仅用GM-CSF 进行诱导培养,得到的BMDC 中未成熟和成熟DC 均有,若要进一步提高成熟度,需用LPS 或TNF-α再诱导1-2 天,其中成熟DC 细胞的含量将达到50-70%。

培养步骤:


1. 小鼠骨髓细胞的获得
见Inaba 法(改良)中的相应步骤,注意省去溶血步骤。


2. BMDC 的大量制备
2.1 步骤1 中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为2 x 105/ml;
2.2 铺至100mm 细菌培养皿(Petri Dish)中,每皿10ml 细胞,同时加入重组小鼠GM-CSF (200U/ml,对于PeproTech 的GM-CSF,相当于20ng/ml),37℃,5%CO2 培养箱培养;
注:此处使用的是细菌培养皿,而非细胞培养板。
2.3 第3 天时,向培养皿中再加入10ml 含20ng/ml 重组小鼠GM-CSF 的完全培养液;
2.4 第6 天和第8 天分别半量换液,即收集旧培养液,离心后用含20ng/ml 重组小鼠GM-CSF 的完全培养液重悬细胞沉淀,然后再将细胞悬液放回原皿;
2.5 第10 天时可收集细胞,即为BMDC。


3. BMDC 的完全成熟
3.1 培养第10 天的DC 用移液器轻轻吹打收集悬浮细胞,300 x g 室温离心5min;

3.2 弃上清,用10ml RPMI 1640 完全培养液重悬细胞沉淀,然后铺于100 mm 细胞培养板;

3.3 加入重组小鼠GM-CSF(100U/ml , 相当于PeproTech 的10ng/ml) 和TNF-α (500U/ml),或重组小鼠GM-CSF(100U/ml,相当于PeproTech 的10ng/ml)和LPS (1μg/ml);
3.4 37℃,5% CO2 培养箱继续培养1-2 天。


【BMDC 的鉴定】


1. 形态学观察:BMDC 多数呈集落生长,细胞有多个树突样突起,成熟的BMDC 更加明显;
2. 细胞表型分析:流式细胞术检测DC 细胞表面CD11c,CD40,CD80,CD86,MHCII 类分子(I-A/I-E)等的表达,BMDC 高表达这些分子,完全成熟的BMDC 中这些分子的表达会进一步提高。
3. 混合淋巴细胞反应(MLR):BMDC 具有较强的刺激能力,且成熟度越高,刺激能力越强。



【注意事项】


1. 小鼠品系和性别:
多数研究表明,所使用的小鼠品系与获得BMDC 的数量和成熟度关系不大,但也有研究表明C57BL/6 小鼠可能更好。
Lutz 表示从C57BL/10,DBA/2,C3H/J 和129 等小鼠品系均可获得足够数量和纯度的BMDC,但Lutz 在其实验中更倾向于使用C57BL/6,ICR 和BALB/c 小鼠,且发现C57BL/6 小鼠的BMDC 产量最高,而且ICR 小鼠和C57BL/6 小鼠的BMDC 对LPS的成熟诱导敏感度高于BALB/c 小鼠。
关于小鼠的性别,Inaba 认为雄性小鼠更好些,因为他们的骨骼更大,从而可以获得更多的前体细胞,但多数学者更倾向于使用雌性小鼠。因此,目前培养BMDC 用的比较多的小鼠是雌性或雄性C57BL/6 小鼠。


2. 单独使用GM-CSF 还是联合使用IL-4?
Inaba 经典法和Lutz 大量制备法中均仅用GM-CSF 即可诱导出相当数量的BMDC,而且也在混合淋巴细胞反应中表现出较强的刺激作用,但其实这些BMDC 的成熟度并不足够高。
研究显示,GM-CSF+IL-4 联合诱导比GM-CSF 单独诱导产生的BMDC 表达更高的MHC II 类分子和共刺激分子CD80 和CD86 等,提示前者具有更强的抗原递呈能力,而且前者在混合淋巴细胞反应中表现出更有效的刺激能力。在动物实验中也发现,GM-CSF+IL-4 联合诱导的BMDC 可产生保护性抗肿瘤免疫反应,而GM-CSF 单独诱导的BMDC 的保护性较弱,这些都说明GM-CSF+IL-4 联合诱导的BMDC 的成熟度高于GM-CSF 单独诱导的BMDC。
德国明斯特大学(University of Munster)的Labeur 研究也表明,单独用GM-CSF 诱导的BMDC 为未成熟DC,GM-CSF 和IL-4 联合诱导产生的BMDC 的成熟度居中,添加CD40L 或LPS 可进一步诱导BMDC 完全成熟。

因此笔者认为,要想获得功能更好的BMDC,最好用GM-CSF 和IL-4 联合诱导骨髓细胞。而且,如果能在Inaba 经典法和Lutz 大量制备法中添加IL-4,应该会获得更加成熟、有效的BMDC。

3. 成熟诱导剂的选择

LPS,CD40L 和TNF-α无论对人DC 还是小鼠DC 均是常用、有效的成熟诱导剂,那么应该选择哪个呢?
TNF-a 诱导DC 的成熟能力在三者中最弱[7,8]。LPS 和CD40L 均是DC 体外完全成熟的强诱导剂,两者诱导DC 的成熟度相似,但诱导产生的细胞因子谱有差异。CD40L诱导成熟的BMDC 在体内显示出最强的免疫调节能力,包括保护性和治疗性肿瘤免疫反应的产生。
用LPS 刺激DC 完全成熟所用的浓度一般为1-10μg/ml,但其实0.1 μg/ml 已经有非常强的作用,但保险起见,一般选用1μg/ml。
对于CD40L 需要注意的是,CD40L 分子属于TNF 配体家族,该家族的特点是在形成三聚体后才能发挥作用。所以最好能用重组的CD40L 三聚体蛋白来刺激DC,这样会有很好的效果。如果用CD40L 单体来刺激DC,多数情况下成熟度并不是很高。


4. 培养方法的选择



【BMDC 相关试剂推荐】



注:用于DC 鉴定的表面标志物的表达在流式图上均呈现单个峰,且多数情况下不能与阴性峰完全区分开来。为避免多色分析时补偿调节不好导致结果的不准确性,建议最好用单标,最多用双标来做DC 表面标志的分析,而且必须使用同型对照,而非空白细胞对照来排除背景染色。


原文下载链接:http://www.nbs-bio.com/article_cat-21.html

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