凝集素应用手册 (免疫组化-免疫荧光IF)
Vectorlabs提供多种与传统及新型染料结合的凝集素，可为单一或多重染色提供多种选择。当与抗体检测结合时，这种多重荧光染色可实现重叠的目标分子的可视化观察，例如感兴趣的蛋白质和特定的糖链。荧光显微镜的另一个特点是能够评估每个通道的相对荧光量，从而在采集设置相同的情况下对样品进行比较。为了进一步鉴定由人类胚胎干细胞分化产生的不同细胞类型，Dodla等人使用了八种凝集素分别进行IF，结果证明野豌豆凝集素(VVL/VVA)可以将人类神经祖细胞与间充质祖细胞和胚胎干细胞区分开来——这一证据表明凝集素可以作为沿着分化途径分离不同细胞群的工具(Ref. 45)。
关于IF，如果想了解更多，可以参考Vectorlabs的免疫荧光(IF)指导手册。
精选文献
• Visualize abnormal glycosylation compartmentalization in cancer (Ref. 11)
• Characterize cell subpopulations by unique lectin binding patterns (Ref. 45)
• Quantitate the change in glycan structure due to enzyme loss/mutation (Ref. 39)
• Differentiate intracellular parasites from host cells (Ref. 19)
实验流程概览
样本准备
• 使用Vectorlabs的ImmEdge 免疫组化笔(H-4000)隔离样本以减少试剂的使用。
抗原修复
• 根据实际情况，选择合适的基于pH或酶的抗原修复条件。
封闭
• 使用Vectorlabs的Carbo-Free™ Blocking (CFB*，SP-5040-125)室温下孵育样本30分钟。
Note：与其他常见的含蛋白质的封闭剂，如血清、脱脂奶粉或酪蛋白不同；CFB不含糖蛋白。
检测
• 加荧光标记凝集素，室温孵育1小时(或者，在4°C下孵育过夜)。建议凝集素的初始工作浓度为0.5–10ug/ml，具体浓度需要用户进行优化。如需放大信号，推荐使用生物素标记的凝集素，然后搭配使用链霉亲和素-荧光素结合物；
• 使用TBS清洗载玻片, 5min/次，共3次。
去除自发荧光
• 推荐Vectorlabs的Vector® TrueVIEW®自发荧光猝灭试剂盒(SP-8400或SP-8500)，去除组织切片中由于醛固定、红细胞以及胶原蛋白、弹性蛋白结构造成的自发荧光。
显色
• 如果使用生物素标记的凝集素，此时应加入链霉亲和素-荧光素结合物；
• 使用TBS清洗载玻片，5min/次，共3次；
• 轻轻擦干载玻片。
封片
• 推荐使用Vectorlabs的VECTASHIELD® Antifade系列防荧光淬灭封片剂，进行封片。
观察结果
• 通过荧光显微镜观察结果
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