凝集素应用手册 ( 酶分析—糖基转移酶/糖苷酶 )
通常情况下，样本中的糖基转移酶和糖苷酶的浓度很低，很难直接检测。通过测量酶的底物或产物的变化来确定糖基转移酶(一种添加糖基的酶)或糖苷酶(一种去除糖基的酶)的存在则成为更实用的方法之一。对于糖基转移酶，底物数量的减少和酶产物数量的增加是检验酶存在和活性的依据。相反，底物的减少则意味着糖苷酶的存在。通过使用凝集素来跟踪底物和产物的相对量，可以建立多种检测方法来监测酶的活性。
为了在体内特定位点引发抗炎反应，Pagan等人(Ref.9)制备了半乳糖基转移酶-唾液酸转移酶-IgG融合蛋白作为单一大分子。然后，他们通过将这一重组大分子与供体核苷酸-糖和受体胎球蛋白一起孵育，并使用凝集素印迹监测酶产物，来检测这一融合蛋白是否保留了酶活性。
精选文献
• Determine the activity of recombinantly expressed proteins (Ref. 9)
• Demonstrate the activity and specificity of bacterial enzymes (Ref. 24)
• Verify and validate genetic over- or underexpression systems (Ref. 20)
• Discerning enzymatic presence in novel systems (Ref. 44)
• Monitor glycosylation output after glycosyltransferase manipulation (Ref. 101)
实验流程概览
样本制备
• 制备酶样本；
• 制备酶底物. 通常是活的或固定的细胞、溶液中的或固定的糖蛋白、溶液中的或固定的纯化的糖。
封闭
• 为了减少与底物的非特异性相互作用，可考虑在系统中加入阻断剂；如：在室温下，在Vectorlabs的CFB溶液中(Carbo-Free™ Blocking，
SP-5040-125)孵育底物30-60分钟；
• 用兼容的洗涤缓冲液室温下清洗两次(2×)。
反应
• 加入含有酶的反应缓冲液，糖基转移酶需要核苷酸-糖供体, 糖苷酶则不需要。这两种酶对pH值和阳离子浓度都非常敏感, 因此需要相应地优化反应缓冲液；
• 将酶与底物轻柔混合孵育；时间和温度需用户进行优化，我们建议以室温和37°C之间孵育2-4 小时作为起点；
• 尽可能将反应物与原材料分离，用兼容的清洗缓冲液室温下清洗两次(2×）。
检测
• 加入荧光标记凝集素，室温下(或4℃条件下孵育过夜)与反应物共孵育1小时。根据实验需求，也可选择使用生物素标记的凝集素；
• 用兼容的洗涤缓冲液室温洗涤三次(3×)。
显色
• 如果使用了生物素标记的凝集素，此处需加入荧光标记链霉亲和素继续孵育；
• 用兼容的洗涤缓冲液室温洗涤二次(2×)。
信号采集
• 图像采集，数据分析。
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